Synteza genów to biologiczny proces budowy i montażu nowych genów z nukleotydów de novo. Sztuczna synteza genów, czyli syntetyczna synteza genów, różni się od syntezy DNA zachodzącej w żywych komórkach. Istotną różnicą jest to, że nie wymaga ona prototypowego DNA. Pozwala ona na tworzenie syntetycznych cząsteczek DNA, które nie mają ograniczeń co do wielkości ani sekwencji nukleotydów. Ponadto, można kopiować i syntetyzować dowolną sekwencję, niezależnie od tego, czy występuje ona naturalnie, czy nie. Badania i postęp w syntezie genów doprowadziły do ogromnego postępu w biologii, dzięki czemu naukowcy mogą teraz łatwo przeprogramować całe genomy i komórki.
Naukowe korzyści płynące z syntezy genów obejmują:
- Naukowcy wykorzystali syntezę genów do wyodrębnienia warunków, w jakich namnażają się komórki nowotworowe raka piersi. Stworzyło to podstawę do stworzenia terapii, które mogą skutecznie leczyć raka.
- Kiedy naukowcy przeprowadzają sekwencjonowanie wirusów przy użyciu sztucznej syntezy genów, powstają bezpieczniejsze i skuteczniejsze szczepionki oparte na DNA.
- Wariant rodopsyny Chanel umożliwia aktywację neuronów głębokiego mózgu poprzez nieinwazyjną aktywację optyczną.
- Biolodzy roślin mogą wykorzystywać syntezę genów do badania przeprogramowania rozwojowego w tkankach naczyniowych roślin. Podczas podejmowania takich badań można zastosować zamrażanie, aby pomóc w zachowaniu próbek genów. Mając to na uwadze, sprawdź te liofilizatory które idealnie nadają się do konserwacji materiałów wrażliwych na temperaturę.
Etapy syntezy genów
Naukowcy przeprowadzając syntezę genów, stosują pięcioetapowy proces. Pięć kroków to:
- Optymalizacja projektowania i sekwencji Oligo
- Synteza oligo
- Montaż genów
- Weryfikacja i korekta
- Przygotowanie syntetycznego DNA
1. Projektowanie Oligo i optymalizacja sekwencji
Pierwszym krokiem w tym procesie jest wybór genu, który Cię interesuje. Po wyizolowaniu genu będziesz musiał stworzyć sekwencję, którą chcesz zsyntetyzować. Na przykład, jeśli Twoim celem jest maksymalizacja poziomów ekspresji białek heterologicznych, idealną ścieżką jest optymalizacja kodonów. Z drugiej strony proces ten może nie być przydatny, jeśli zamierzasz badać wewnętrzną regulację ekspresji genów. Oto najpopularniejsze narzędzia wykorzystywane w procesie projektowania Oligo oraz ich zalety i wady:
- DNA działa: jest łatwe w użyciu i może przewidzieć wynik błędnej hybrydyzacji Oligo. Jednakże wyniki oparte na symulacji mogą nie odzwierciedlać dokładnego rzeczywistego sukcesu w montażu.
- Gene2Oligo: Interfejs jest łatwy w użyciu i zawiera zespoły oparte zarówno na LCR, jak i PCR. Z drugiej strony nie będzie to przydatne, jeśli Twój gen jest dłuższy niż jeden kilobajt.
- TMPrime: TMPrime: Oferuje zarówno zespoły oparte na LCR, jak i PCR oraz szeroki zakres temperatur topnienia i przyłączania. Jedyną wadą jest to, że niedoświadczonym użytkownikom interfejs może wydawać się skomplikowany. Aby móc przesyłać dokładne dane, użytkownicy muszą znać różne parametry wejściowe.
Kiedy sfinalizujesz sekwencję do syntezy, następnym krokiem jest podzielenie genu na mniejsze fragmenty w celu syntezy i złożenia. Czynniki wpływające na ten etap obejmują długość Oligo, tendencję do tworzenia spinki do włosów i powtórzenia sekwencji.
2. Synteza oligo
Pierwszym etapem syntezy DNA jest utworzenie krótkich oligonukleotydów. Naukowcy osiągają to, wykorzystując chemię amidofosforynową do łączenia monomerów nukleotydowych. Chemia fosforoamidytów jest korzystna, ponieważ zapobiega angażowaniu rosnącej nici w niepożądane reakcje podczas procesu formowania. Łączą grupę fosforoamidynową z 3'O, aby zapobiec niepożądanemu rozgałęzianiu podczas tworzenia. Grupa fosforoamidytów zawiera diizopropyloaminę, która zapewnia ochronę i metylowany fosforyn. Czteroetapowy cykl reakcji fosforoamidytu jest następujący:
- Odbezpieczenie: W tym przypadku usuwają DMT poprzez przemywanie łagodnym kwasem, takim jak kwas trichlorooctowy. To ujawnia 5'O dla reakcji.
- Sprzęganie: 3'O drugiego nukleotydu łączy się z 5'O pierwszego nukleotydu.
- Capping: Tutaj wszystkie 5'OH dowolnego nukleotydu, który nie uległ akolitowi, pomagają w taki sposób, że nie angażują się w niepożądane reakcje w dalszej części procesu.
- Utlenianie: Tutaj dodają jod, tworząc wiązanie fosfodiestrowe z wiązania trójestrowego fosforanu, co prowadzi do utworzenia szkieletu DNA.
Eksperci wykonują ten etap za pomocą kolumny laboratoryjnej lub specjalistycznego syntezatora.
3. Zgromadzenie genów
Etap ten ma na celu złożenie fragmentarycznych oligo w kompletne geny lub elementy składowe genomów. W składaniu genów przydatne są cztery typy składania. Skuteczność metody składania genów zależy od długości sekwencji, którą chcą połączyć. Najpopularniejsze metody montażu to:
- Reakcja łańcuchowa ligazy lub LCR: Używają ligazy DNA do łączenia nakładających się końców syntetycznych oligo.
- Zespół łańcucha polimerazy: łączą wszystkie jednoniciowe oligo w jednej tubie, a następnie poddają termocyklingowi, aby ułatwić łączenie.
- Rekombinacja homologiczna in vivo w drożdżach: idealna do długich nici nukleotydowych do 200 nukleotydów i 1000 bp.
- Klonowanie niezależne od sekwencji i ligacji: wykorzystują wektor plazmidowy do złożenia do pięciu fragmentów genów. Robią to poprzez włączenie go do wektora plazmidowego.
4. Weryfikacja i korekta
Czwarty krok polega na weryfikacji utworzonej sekwencji i naprawieniu ewentualnych błędów, które mogły pojawić się w trakcie procesu. Wiąże się to również z testowaniem wszystkich sekwencji przed dopuszczeniem ich do użytku. Wszelkie sekwencje posiadające mutacje są usuwane z zebranej puli. Inne procesy wchodzące w skład kontroli jakości obejmują:
- Wstawienia
- Usunięcia
- Przedwczesne zakończenie
Czasami eksperci nie mogą uzyskać prawidłowej sekwencji z puli zsyntetyzowanego DNA do amplifikacji. Używają tutaj różnych metod wykrywania i korygowania błędów. Naukowcy mogą zdecydować się na rygorystyczną hybrydyzację starannie zaprojektowanych oligo. Mogliby także wybrać elektroforezę jako wyczerpującą metodę oczyszczania. Inną realną opcją jest spektrometria mas. Stosowana przez nich metoda biochemiczna zależy od przewidywanej przez nich skuteczności w oczyszczaniu DNA.
Inne stosowane przez nich metody obejmują wiązanie niedopasowania, które jest również znane jako rozszczepianie niedopasowania. W tym przypadku wykorzystują endonukleazy prokariotyczne – proces, w którym stosuje się testy funkcjonalne w celu skorygowania prawidłowych sekwencji.
Przed przystąpieniem do procesu wskazane jest zrozumienie, że tylko około jedna trzecia całego syntetyzowanego produktu będzie miała pożądaną jakość. Aby uprościć proces, klonują tylko te nici, w przypadku których nie stwierdzono błędów. Praca z laboratorium lub programem, który rozumie
5. Przygotowanie syntetycznego DNA
To jest ostatni krok w tym procesie. Tutaj syntetyczny DNA jest gotowy do dalszych zastosowań. W ramach przygotowań do zastosowań końcowych użytkownika bierze udział kilka procesów:
- Klonowanie: klonują syntetyczne geny do użytecznych wektorów, które obejmują wektory plazmidowe lub wirusowe. Czasami eksperci projektują syntetyczne geny, które ograniczają miejsca enzymów, ramiona rekombinowane i inne sąsiadujące sekwencje.
- Rozmnażanie: Syntetyczne geny są trudne do rozmnażania z kilku powodów. Po pierwsze, ekspertom trudno jest amplifikować konstrukty plazmidowe o niskiej liczbie kopii przy użyciu gospodarzy bakteryjnych. Ponadto niektóre geny zmieniają fizjologię swoich gospodarzy i ostatecznie długie geny wyczerpują komórkę gospodarza z powodu obciążenia energetycznego, jakie na nią wywierają. Czasami eksperci mają do czynienia z genami, które są toksyczne u poszczególnych żywicieli i nieszkodliwe u innych. Naukowcy spróbują zidentyfikować idealnego żywiciela bakteryjnego, który zapewni powodzenie procesu namnażania.
- Bezpieczeństwo biologiczne: Wreszcie odpowiednie organy otrzymają raporty na temat zastosowanego procesu, ocenią dowody i ustalą, czy powstały produkt jest bezpieczny dla ogółu populacji. Na przykład Komitet Doradczy ds. Rekombinacji DNA dokonuje przeglądu protokołów, aby upewnić się, że przestrzegane jest bezpieczeństwo i że produkt nie będzie stwarzał zagrożenia dla środowiska.
Wniosek
Synteza genów jest bardzo korzystna, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Te pięć kroków poprowadzi Cię przez cały proces. Jeśli zastanawiasz się nad stworzeniem syntetycznego genu do dowolnego celu, koniecznie skontaktuj się z ekspertami, aby mieć pewność, że wykonasz właściwy krok w najdokładniejszej kolejności.